陈书畅，徐晔，曲乐天，夏腾，刘毅，许建和，程汉良
（江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏 连云港 222005）
鲤（Cyprinus carpio）食性广、生长速度快，适应性强，食用价值高，是世界尤其是我国传统的养殖鱼类。随着水产养殖业朝着高密度、集约化方向发展，提高鱼体免疫力和抗病力显得尤为重要[1]。
肠道健康对于鱼类的健康养殖意义重大。肠道发挥着多种作用：消化和吸收营养物质、抵抗病原微生物和食物抗原对机体的影响、参与抗菌肽和摄食调控类激素的分泌等[2]。肠道内定植着大量微生物，这些微生物也通过自身或其代谢产物影响鱼类的营养代谢、系统发育、免疫调节等生理过程[3]。许多研究表明，益生菌在宿主肠道的粘附作用具有特异性，非同源的益生菌在养殖生产中的应用效果并不理想[4]。所以种属特异性是筛选益生菌首要条件，从水产动物肠道中分离筛选益生菌是目前大多数水产益生菌的主要筛选方法。因此，探究鱼源益生菌生物特性，寻求一种高效安全的饲料添加剂型益生菌菌种势在必行。本研究通过筛选一种安全有效、有较强产酶能力的鲤源益生菌，以期为鲤源益生菌的益生特性分析和安全使用提供参考，及为鲤益生菌制剂和发酵饲料的研发提供科学依据。
1.1 材料
试验用鱼采自江苏海洋大学水产养殖实验室，试验前摄食鲤配合饲料。饲料制作完成后，采用高温高压灭菌处理（121℃、0.5 Mpa、灭菌15 min）。每天上午10：00 和下午3：00 各投喂一次，养殖4 周；
养殖期间，水中溶氧量＞5 mg/L，水温保持在（26±1）℃。
1.2 方法
1.2.1 取样
试验鱼饥饿24 h 后，选择3 尾活泼、无外伤、体形正常的健康鲤，体质量（109.6±2.8）g。经MS-222麻醉，用无菌水冲洗数次，体表用75%的酒精消毒，在洁净工作台上，用无菌剪刀分离肠道，称取3 尾鲤前肠共4.5 g，用灭菌生理盐水冲洗数遍，剪碎，放入50 mL 灭菌的离心管中，加20 mL 灭菌生理盐水，匀浆，再加20.5 mL 灭菌生理盐水，制成10-1稀释原液，放入4℃冰箱保存备用。
1.2.2 培养基的配制
实验所用LB 和MRS 培养基购于北京陆桥技术有限责任公司，芽孢杆菌富集培养基的配制参照王妹等[5]的方法，淀粉培养基、脂肪培养基配制参照罗璋[6]的方法，脱脂牛乳琼脂培养基参照沈萍等[7]的方法。
1.2.3 细菌计数
稀释鲤肠道原液，分别取各稀释液100 μL 均匀涂布在LB、MRS 和芽孢杆菌富集培养基上，37℃倒置培养18～24 h，参照国家标准GB 13093-91，计算各培养基中细菌的数量[8]。
1.2.4 产酶菌株的初步筛选
分别纯化LB、MRS、芽孢杆菌富集培养基中的细菌，各110 株，编号为：BH1001-BH1110、BH2001-BH2110、BH3001-BH3110。取培养出的单菌落用接种环点在淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶筛选培养基上，进行筛选[9]。
1.2.5 菌株产酶活力测定
将上述筛选出的菌株分别接种于相应的液体培养基中，在28℃下培养18～24 h，4 000 r/min 离心30 min，取上清液用南京建成生物工程研究所有限公司的蛋白酶试剂盒、淀粉酶试剂盒和脂肪酶试剂盒进行测定[10]。
1.2.6 溶血试验
溶血平板购于北京陆桥技术有限责任公司，取纯化后的单菌落接入溶血琼脂平板，37℃倒置培养24 h 后观察是否有溶血圈生成。
1.2.7 菌株药敏实验
参照文献[11]，采用药敏纸片，每种抗菌药物纸片（购于杭州滨和微生物试剂有限公司），均设3 个重复。实验结果依据《WS/T125-1999 纸片法抗菌药物敏感试验标准》进行判断。
1.2.8 16S rDNA 分子鉴定
采用细菌16S 通用引物（27F）：5′-AGAGTTTG ATCMTGGCTCAG-3′（1492R）：5′-TACGGYTACCTT GTTACGACTT-3′。接种单菌落于LB 液体培养基中，37℃、振荡180 r/min，培养24 h；
取2.5 μL 的上一步产物作模板。PCR 反应体系见表1。
表1 细菌16S rDNA 扩增体系Tab.1 16S rDNA amplification system of the bacteria
PCR 反应循环参数：95℃5 min，（94℃30 s，54℃30 s，72℃，30 s）共30 cycles，72℃7 min，12℃∞。
取5 μL 的PCR 产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。条带大小与预期大小相同，条带单一且明亮。PCR 产物直接送上海生工测序。
1.2.9 生理生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]，采用细菌微量生化反应管测定分离菌株生化特征，生理生化反应管购置于杭州滨和微生物试剂有限公司，并用一株由本实验室保存的枯草芽孢杆菌作参照菌，进行对照实验。
1.3 数据处理
使用Excel 2010 进行数据统计分析，应用相应函数计算平均值和标准差；
采用IBM SPSS Statistics 23 软件对试验数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），数据差异显著时，采用Duncan′s 检验法进行多重比较，差异水平定为0.05。
2.1 鲤肠道的细菌数量
鲤肠道在LB 固体培养基中的细菌数量为4.7×1015cfu/g，MRS 固体培养基中的细菌数量为8.0×1013cfu/g，芽孢杆菌固体富集培养基中的细菌数量为6.7×1013cfu/g。
2.2 产酶菌株的初步筛选
从正常养殖的鲤肠道中分离出330 株菌株，经初步筛选，能同时产三种酶的菌株35 株,其中12 株来自LB 固体培养基，7 株来自MRS 固体培养基，16株来自芽孢杆菌富集培养基。根据菌株的透明圈直径与菌落直径比值结果，挑选出10 个值大的菌株BH1025、BH1065、BH1103、BH2094、BH2104、BH3 007、BH3044、BH3066、BH3080 和BH3098 进行本试验，按顺序重新进行编号J1～J10。
2.3 产酶菌株的酶活测定
各菌株产蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的比较结果见图1～图3，不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。综合菌株的三种产酶活力，J3、J5、J10 优于其他菌种。
图1 各菌株产蛋白酶活力的比较Fig.1 Comparison of protease activity among different strains
图2 各菌株产脂肪酶活力的比较Fig.2 Comparison of lipase producing activities among different strains
图3 各菌株产淀粉酶活力的比较Fig.3 Comparison of amylase activity among different strains
2.4 菌株溶血实验
在J1-J10 菌株溶血性试验中，J2、J3、J5、J7、J9和J10 菌株不产生溶血圈，说明这些菌株不释放溶血毒素，是相对安全的候选益生菌。
2.5 菌株药敏实验
综合菌株的产酶能力、溶血性实验结果，拟选J3、J5、J10 为备选益生菌株。各菌株的药敏实验结果见表2。菌株J3 对青霉素、红霉素、利福平、氨苄西林和麦迪霉素抗生素产生了耐药性，菌株J5 对青霉素抗生素产生了耐药性，菌株J10 号对青霉素、红霉素、环丙沙星、氯霉素、氨苄西林和麦迪霉素抗生素产生了耐药性。菌株是否携带耐药因子，是环境释放安全与否的重要指标之一[13]，为了保证安全性，最终选定J5 为候选益生菌株。
表2 各菌株的药敏实验结果Tab.2 Drug sensitivity test results of each strain
2.6 16S rDNA 分子鉴定
将测得菌株J5 的16S rDNA 序列在GenBank中进行blast 序列比对。结果显示：J5 细菌与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 的相似性为100%。
2.7 生理生化鉴定
拟选菌株的生理生化结果见表3。与《常见细菌系统鉴定手册》比对，再参照16S rDNA 测序结果，最终确定J5 为Bacillus subtilis。
表3 J5 的生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical characteristics of J5
本研究以筛选适合鲤饲料添加型的益生菌为主要目的。根据鱼类的食性选择合适的益生菌，草食性的鱼可选择产淀粉酶高的细菌做益生菌，肉食性的鱼可选择产脂肪酶高的细菌作益生菌。鲤为杂食性鱼类，应该选择分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶能力较强的细菌作为益生菌[6]。在筛选益生菌的过程中，初步比较了细菌的产酶能力，并进一步检测了细菌的溶血性和抗生素的敏感性，将产酶能力和安全性高、携带抗生素耐药因子少的菌株筛选出作为潜在益生菌，进行下一步试验。
益生菌通常作为疾病控制剂的辅助剂，甚至替代抗生素应用于水产养殖动物疾病防治中[14]。益生菌具有提高动物消化吸收饲料的重要作用[15-17]。本实验初筛具有同时产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力的菌株35 株，选取10 种透明圈直径/菌落直径较大的菌株，进一步测定产酶能力，发现比值的大小与菌株产酶能力的大小并不具有很强的相关性，产酶能力的高低须经具体测定酶活方可确定。产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力比较分析表明，J3、J5、J10 产酶活力强。
益生菌的筛选到应用存在着安全隐患，候选菌株是否具有较强的抗药性，是否产生溶血毒素都是必须要考虑的问题。本实验进行了菌株药敏性和溶血实验，发现部分菌株具有很强的耐药性，尤其是对常见的抗生素，这可能与鱼类养殖中频繁使用抗生素有关。黄志坚等[18]检测了194 株（62 个属）分离自水产养殖生物和养殖环境的革兰氏阴性菌和阳性菌对5 种常用抗生素的抗性。结果表明水产养殖生物和养殖环境中均存在不同程度的抗生素污染。部分菌株在进行溶血实验时存在着较大的溶血圈，表明这些菌株会产生溶血毒素，是潜在的致病菌，应排除在候选益生菌之外。综合产酶能力和细菌的溶血性结果，菌株J3、J5 和J10 更具有开发前景。但菌株J3 对5 种抗生素产生了耐药性，菌株J10 号对6 种抗生素产生了耐药性。该菌株中可能存在耐药因子，这是环境释放安全与否的重要指标之一[11]，所以为了保证安全性，应将该菌株舍弃。
菌株J5 具有较强的分泌蛋白酶、淀粉酶和淀粉酶能力；
对绝大多数抗生素敏感，安全性更好，参照16 S rDNA 测序结果，并与《常见细菌系统鉴定手册》比对，最终确定J5 为枯草芽孢杆菌。该菌是我国农业农村部批准的可以作为饲料添加剂的微生物菌种，更具有开发前景。