自生固氮菌的分离纯化,一、目的要求 1、学习微生物纯系分离、培养方法。
2、掌握划线分离纯化微生物的方法。
二、基本原理 为了生产和科学研究的需要，往往需要从自然界混杂的微生物群中分离单一的菌种，这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离。,为了获得某种微生物的纯培养，可采用下列两种方法一种是提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。如要从土壤中分离自生固氮菌，则其培养基中是不能含有N源，这种培养基就比较适于能利用空气中N2的微生物。另一种方法是在培养基中加入某种化学物质，以抑制人们所不需要的微生物的生长繁殖。分离土壤中真菌，往往在分离真菌的马丁培养基中加入适当的孟加拉红，链霉素和金霉素等化学药品，目的在于抑制细菌生长，这样更有利于获得其纯培养。,土壤中微生物数量众多，在肥沃土壤中固氮菌数量也很多，自然界中多数氮素养料是由微生物固氮的结果，固氮菌一般可分为自生固氮菌和共生固氮菌两类。
要分离自生固氮菌，常用阿斯毕无氮培养基这种选择培养基，控制其适宜环境条件，使它在培养基上大量繁殖，然后通过稀释法和划线分离纯化法，使它在培养基上形成单菌落，如分离所得不纯，需要进一步纯化，直到得到纯种.,三、材料与仪器,1、培养基阿斯毕无氮培养基。
2、菜园土。
3、灭菌培养皿、镊子、剪刀、接种针、酒精灯等,四、方法与步骤,（一）富集培养 1、用已灭菌后冷却至50oC左右的阿斯毕培养基倒成平板。
2、用已灭菌的镊子将黄豆粒大的菜园土摆入已冷凝的平板培养基上。
3、正面放置培养箱中培养，28oC培养34天后，在土粒周围有混浊半透明的胶状菌落出现，有的在后期会产生褐色的色素。,（二）划线分离纯化下次实验,1、用已溶化至50oC阿斯毕培养基倒入平板。
2、用接种环挑取上述菌落少许，在冷凝平板上进行划线分离，而后置28oC培养4天。
划线方法如图,1,2,3,4,（三）纯化、镜检，得到纯种培养,1、平板上出现单菌落，按无菌操作移入阿斯毕培养基斜面试管中，28oC培养4天。
2、镜检将斜面菌株进行涂片、染色、镜检。如是粗短杆状或球状的单一形态的菌体细胞较大，常呈单个或“8”字排列，在细胞表面有较厚的荚膜者，即为自生固氮菌。如有杂菌，需要进一步划线纯化。
3、将得到纯化菌株，移接到另一阿斯毕培养基斜面管，28oC培养34天，即获得纯培养菌，可冷冻保存，备用。,五、注意事项,（1）在微生物分离、纯化每一操作环节，要严格按照无菌操作进行。
（2）平板划线时，划线部位不可重叠。
（3）划线时，每次都要将接种环上多余菌体烧掉。
（4）培养皿要贴标签，包括班级、姓名,六、思考题,1、分析阿斯毕培养基成分，说明其适用于分离自生固氮菌的原因。
2、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉划线为何不能重叠 3、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养应注意哪些问题。,稀释平板计数法,微生物的平板计数是根据在固体培养基上所形成的菌落,即是由一个单细胞繁殖而成,且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的.也就是说一个菌落即代表一个单细胞.,计数时,首先将待测样品制成均匀的,一系列不同浓度的稀释液,并尽量使样品中的微生物细胞充分分散开来,使成单个细胞存在否则一个菌落就不是代表一个菌,再取一定稀释度,一定量的稀释液接种到培养皿中,并使其均匀分布于培养皿中的固体培养基中,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可计算出样品中的含菌个数.,十倍稀释法示意图,依次各1ml 1g 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 样品 99ml 每管各9ml无菌水 无菌水 每皿15ml 琼脂培养基,1,1,1,十倍稀释法示意图,依次各1ml 1g 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 样品 99ml 每管各9ml无菌水 无菌水 每皿15ml 琼脂培养基,1,1,1,操作步骤,1、稀释样品十倍稀释法）2、稀释液的分离 3、观察计数结果下次实验做 总活菌数/1克样品同一稀释度菌落平均数 X 稀释倍数.,