MAL基因在原发食管癌组织表达及临床意义作者陈皓作者单位泰安市中心医院肿瘤外科，山东泰安 271000【摘要】目的探讨MAL基因表达下调与食管癌病理分期、组织学分级的相关性。方法 采用RT-PCR和半定量RT-PCR方法检 测45例食管癌组织和癌旁食管黏膜组织中MAL基因的表达。结果40例食管癌组织中MAL mRNA表达明显低于相应的癌旁食管黏膜 组织X230.59,P0.01;IH期病人的MAL基因表达水平显著高 于皿期病人t5.952,PV0.001,淋巴结转移阳性病人 MAL mRNA表 达水平显著低于淋巴结转移阴性病人t6.743,PV0.001。结论MAL mRNA在食管癌组织中的表达与临床分期、组织学分级等临床病理因 素有一定相关性，可作为判断食管癌恶性程度、转移潜能及预后的实 验室指标。【关键词】食管肿瘤;MAL基因;逆转录聚合酶链反应THE EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OFMAL GENE IN PRIMAR Y ESOPHAGUS CANCER CHEN HAO Departme nt of On cology,Taia n Central Hospital,Taia n 271000,Chi naABSTRACT Objective To explore the releva nee betwee n MAL gene expressi on,cli ni cal stage and histologic grade of esophagus can cer.s The MAL gene expressi on in 45 can cer patie nts was detected with RT-PCR and semi-qua ntitative RT-PCR tech ni que.ResultsThe mRNA expressi on of MAL in 40 can cer tissue samples was lower than that in the surro unding esophagus mucous membra nX 230.59,P0.01.The gene expression in stage and II patients was higher than that in stage 皿 patients t5.952,P0.001.Those with lymph node metastasis showed lower gene expressi on tha n patie nts without t6.743,P0.001.Con clusi on In esophagus can cer,the MAL gene expressi on was associated with histologic grade and cli ni cal stage,which can be used for determ ining tumor malig nancy and predict ing its prog no sis.KEY WORDS Esophageal n eoplasms; MAL gene; Reverse tran scriptase polymerase cha in reacti onMAL基因是由ALONSO等1于1987年分离得到的抑制肿 瘤生长的新基因，MAL基因失活及异常与细胞信号转导、肿瘤的发 生发展和临床预后等有一定关系。近年来，MAL基因与食管癌的关系已成为研究的热点。本研究利用定性和半定量逆转录聚合酶链反应 RT-PCR方法检测食管癌组织及其癌旁组织中MAL基因的表达情况，旨在探讨MAL基因在食管癌发生发展过程中的作用，及其与临 床病理因素的关系，为食管癌发病机制的研究提供新思路。1材料与方法1.1标本来源1.1.1病例选择 2004年6月2006年3月 ，泰安 市中心医院 住院的食管癌病人45例，男25例，女20例;年龄3679岁，平均57.5岁。术前均未发现远处转移，未行放、化疗治疗。手术方式均为 经左胸行食管癌次全切除胃-食管弓上或弓下吻合术，术中无肉眼可 见肿瘤残留。术后病理检查均证实为鳞癌。按 UICC食管癌分期标准 1997进行分期。1.1.2标本取材和保存 食管癌组织及癌旁组织取自食管癌病人手术标本，组织离体后立即无菌取材，从肿瘤生长活跃无坏死的 部位取下约1 cm3癌组织及5 cm外癌旁组织，标本30 min内送实验 室，新鲜提取总RNA;不能保证30 min内制备样品的，在取材后放 -80 C冰箱保存备测。1.2检测方法采用半定量 RT-PCR法检测MAL mRNA的相对表达水平。
总RNA提取采用Trizol提取总RNA，并进行纯度和浓度测定。
RT反应于DEPC处理的Eppendof管中，加入1 Mg总RNA、MMLV及随机引物等，快速离心混匀后，37 C 1 h,95 C 10 min 灭活MMLV，快速离心使蒸气沉于管底。
PCR反应于0.5 mL Eppendof管中加入RT反应产物、PCR反应体系、MAL上游引物5 -AAGATCCTCTGCTGACCCCT-3 、MAL 下游弓 I物5 -ACCATGGACCTCTGGAAAGA-3 、B -actin 上游引物5 -GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 ，以及 B -actin 下游弓 I物5 -CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3 ，扩增片段长度为 500 bp;95 C 5 min，离心使蒸气沉于管底，加Taq DNA聚合酶，快速离 心混匀。循环条件94 C 1 min,58 C 1 min ,72 C 1 min，循环 35次，末次延伸7 min。电泳鉴定，观察目的基因，实验中仅出现一 条500 bp B -actin条带为MAL mRNA阴性;同时出现166 bp条带为MAL mRNA阳性。采用数字图像分析仪2200系统观察拍照并进行半 定量分析，以MAL/ B -actin比值作为MAL mRNA相对表达量，若比 值小于25为表达缺失，若比值小于50则为低表达，低表达与表 达缺失均为异常表达。1.3统计学分析应用SPSS 10.0统计软件，对定性 RT-PCR结果进行X 2检 验及确切概率法；对半定量RT-PCR结果进行t检验。2结果2.1食管癌组织和癌旁组织中 MAL mRNA的定性检查结果 比较45例食管癌组织中未见MAL表达者28例，弱表达者12例; 癌旁组织食管黏膜组织 MAL mRNA全部呈阳性表达。食管癌组织中 MAL mRNA表达明显低于相应的癌旁食管黏膜组织，差异有显著性 X230.59,P0.01。见图 1。图1 RT-PCR检测食管癌组织MAL mRNA的表达、为食管癌组织MAL mRNA表达阳性;、为食管癌组织MAL mRNA表达阴性;为X174/Hae皿分子质量标志物2.2 MAL mRNA 的半定量 RT-PCR检测2.2.1食管癌组织和癌旁组织中 MAL mRNA表达水平比较 本文45例食管癌组织MAL mRNA相对表达水平为0.90士 0.11,而癌 旁组织中MAL mRNA的表达水平为1.51 士 0.27，两者比较差异有统 计学意义（t2.329,P0.05）。2.2.2食管癌组织MAL mRNA表达水平与临床病理分期的 关系MAL mRNA表达水平与食管癌病人性别、年龄无关，但随临床 分期的增高，其表达水平明显降低（PV0.001）,且淋巴结转移阳性者 MAL mRNA表达水平显著低于淋巴结转移阴性者（P0.001）。见表1。
表1食管癌组织MAL mRNA表达水平与临床病理特征的关系3讨论MAL基因定位于2q13,共含有4个外显子，其cDNA长为1 051 bp。MAL是T淋巴细胞成熟相关蛋白，它强烈表达于正常食管 上皮细胞，1987年ALONSO等1报道具有特征性的 MAL cDNA 克 隆呈现在成熟T淋巴细胞上。现已证实，MAL是组成向顶端运输的 细胞膜和分泌性蛋白的必不可少的组成部分26。基于MAL的功能 是诱发广泛的大量囊泡形成，有作者提出,MAL在顶端传送体的形成 中扮演着重要角色7,8。现在已有许多研究证明，MAL表达和人类 食管恶性肿瘤相关。有学者报道，MAL基因在食管癌发生的不同阶 段均表达下调，且从不同角度分析和探讨 MAL基因表达下调的可能 机制，MAL的不表达或表达下调在食管癌发生中可能起决定性作用 9,10。TUGORES等11报道，MAL启动子区设计缺失影响转录子 失活，没有观察到MAL基因组区有遗传性的修改，而且在 13例食管癌细胞株中有3例MAL启动子发生甲基化，9例细胞株中MAL表达正调节。其机制可能为 MAL启动子DNA甲基化和组蛋白脱乙 酰基协同作用于MAL基因导致肿瘤发生。然而，现在仍没有明确 MAL基因在癌组织中表达是否被其他机制调节，如染色体缺失、突 变或其他畸变。功能性测定表明，在癌细胞中外源性MAL的表达可引起细胞运动性降低，在活体内致瘤性下降。本研究采用定性和半定 量两种方法研究了食管癌 MAL mRNA的表达与性别、年龄、临床分 期及组织学分级等因素的关系。结果显示，MAL mRNA的表达缺失在不同性别、年龄中无明显差异，从而推测食管癌 MAL mRNA的表 达缺失与性别、年龄无关，而 MAL基因的表达与食管癌的组织学分 级、临床分期也无相关性，与文献12,13 报道不符，可能与病例数较 少有关。本文研究结果显示，食管癌组织MAL mRNA相对表达量与 癌旁组织比较差异有显著性，且随临床分期和组织学分级的增高，其 表达水平明显降低，即 MAL基因在食管癌组织中表达显著下调。表 明MAL基因表达下调是食管癌发生、发展过程中的一个频发事件。
国内许智雄等14通过PCR分析显示，在食管癌细胞系 EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的 MAL基因片段。本文在研究食管癌组织 MAL基因的表达同时，也探讨了 MAL基因与食管癌淋巴结转移的关系。结果显示，淋巴结转移阳性 组MAL的表达显著低于淋巴结转移阴性组（P0.05），提示食管癌组 织MAL的低表达与淋巴结转移存在显著的相关性，关于 MAL基因 如何调节食管癌淋巴转移的机制仍不十分清楚。淋巴结转移是食管癌的独立危险因素，MAL的低表达与淋巴结转移存在显著的相关性，因此，MAL基因的表达与食管癌的预后有一定的相关性。目前，关 于食管癌MAL基因与淋巴结转移的关系的同类研究尚未见报道，要 得到更加准确和客观的结果还需要更大样本量的研究。【参考文献】1 AL0NS0 M A,WEISSMAN S M.cDNA clo ning andseque nee of MAL,a hydrophobic protein associated with huma n T-cell differe ntiatio nJ.Proc Natl Acad Sci USA,1987,841997-2001.2 CHEONG K H,ZACCHETTI D,SCHNEEBERGER E E,etal.VIP17/MAL,a lipid raft-associated protei n,is invo Ived in apical tran sport in MDCK cellsJ.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96116241-6248.3 PUERTOLLANO R,ALONSO M A.MAL,an in tegraleleme nt of the apical sort ing machi nery,is an iti nera nt prote in that cycles betwee n the tran s-Golgi n etwork and the plasma membra neJ.Mol Biol Cell,1999,103435-3447.4 ALONSO M,BARTON D,FRANCKE U.MAL,amembra ne protein associated with huma n T-cell differe ntiatio n,isen coded on huma n chromosome 2,regi on cen-q13J.Cytoge net Cell Gen et,1987,46570-575.5 MARTIN-BELMONTE F,PUERTOLLANO R,MILLAN J,et al.Expressi on of the MAL gene in the thyroid the MAL proteolipid,a comp onent of glycolipid-e nriched membra nes,is apically distributed in thyroid folliclesJ.En docri nology,1998,1342077-2084.6 MARTIN-BELMONTE F,ARV AN P,ALONSO M A.MAL mediates apical tran sport of secretory protei ns in pola-rized epithelial Madin-Darby canine kid ney cellsJ.J Biol Chem,2001,27649337-49342.7 PUERTOLLANO R,LI S,LISANTI M P,et al.The MAL proteolipid is n ecessary for no rmal apical tran sport and accurate sort ing of the in flue nza virus hemagglut inin in Madin-Darby canine kid ney cellsJ.J Cell Biol,1999,27218311-18315.8 PUERTOLLANO R,MARTINEZ-MENARGUEZ J A,BATISTA A,et al.An in tact dilys in e-like motif in the carboxyl term inus of MAL is required for no rmal apical tran sport of the in flue nza virus hemaggluti nin cargo prote in in epithelial Madin-Darby canine kid ney cellsJ.Mol Biol Cell,2001,1261869-1883.9 MIMORI K,SHIRAISHI T,MASHINO K,et al.MAL gene expressi on in esophageal can cer suppresses motility,inv asi on and tumorige nicity and enhan ces apoptosis through the Fas pathwayJ.On coge ne,2003,223463-3471.10 KAZEMI-NOUREINI S,COLONNA-ROMANO S,ZIAEE A A,et al.Differe ntial gene expressi on betwee n squamous cell carc inoma of esophageus and its no rmal epithelium; altered patter n of mal,akr1c2,and rab11a expressi on J.World J Gastroe nterol,2004,1012101716-101721.11 TUGORES A,RUBIO T,RANCANO C,et al.MAL regulates clathri n-mediated en docytosis at the apical surface of Madi n-Darby canine kid ney cellsJ.DNA Cell Biol,1997,16245-255.12 郭长青，王明荣,李继吕，等.食管癌Mai基因5调控区 的克隆及序列分析J.中华消化杂志，2001,21271-275.13 王子平王明荣，许智雄，等.食管癌MAL基因变化的RNA原位杂交研究J.中华医学遗传学杂志，2000,17329-331.14 许智雄，王明荣，蔡岩，等.人食管癌表达下调基因的分离 和表达分析C//孙力臻.中国科协第二届青年学术会论文集.北京 中国科学技术出版社，1998226-228.论文查重检测