免疫细胞研究wes t e rn blot West e r n Bl o t常见问题及处理总结阿木1、wes t ern blot得优点答灵敏，可达ng级，用Ed显色法理论上 可达pg级、方便，特异性高。2、为什么我得细胞提取液中没有目标蛋白答原因有很多町您得细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b您得细胞中得蛋白质被降解掉了，您必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c您得抗体不能识别目标蛋白，多瞧瞧说明，瞧就是否有问题。3、我得细胞提取液有得有沉淀，有得很清亮，为什么呢答a有沉淀可能因为您得蛋白没有性完全，可以适当提高SDS浓度,同时将样品煮沸时间延长,b也不排除您得抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。4、我做得蛋白质分子量很小10KD,请问怎么做WB答可以选择0。2pnl得膜,同时缩短转移 时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移、其她按步骤即可。5、我得目得带很弱，怎么加强答可以加大抗原上样量、这就是最主要得、同时也可以将一抗稀释比例降低。6、胶片背景很脏，有什么解决方法答减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变抗孵育时间,提高牛奶浓度、7、目标带就是空白，周围有背景，就是为什么答您得一抗浓度较高,二抗上HRP催化活力太强，同时您得显色底物处于一个临界点,反应时间不长，将周围底物催化完，形 成了空白即“反亮现象”。将一抗与二抗浓度降低，或更换新底物。、我得胶片就是一片空白，就是怎么回事答如果能够排除下面得几个问题那么问题多半岀现在一抗与抗原制备上。a ）二抗得HRP活性太强，将底物消耗光;b）ECM底物中H 2 02,不稳定佚活;c）ECL底物没覆盖到相应位置;d）二抗失活。9、我在显影液中显影1分钟与5分钟后，底片漆黑一片，就是什么原因呢答a ）可能就是红灯造成得，胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗得情况下操 作瞧就是否有改善、；b）显影时间过长。10、DAB好还就是ECM好答DAB有毒，但就是比较灵敏，就是HR P最敏感得底物;E CM结果容易控制，但被催化时灵敏度差一点，但如果达到阀 值，就特别灵敏，可以检测pg级抗原。要瞧 您实验得情况。1 K抗原检测出得分子量比资料上得大，就是怎么回事答a）抗原形成了二聚体。增多蔬基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体、b）蛋白本身得修饰如糖基化，磷酸化等1 2、蛋白转移不到膜上，但胶上有，同时M a rke r转上去了，为什么 答可能就是a ）样品浓度过低;b）转移时 间不够,。13、磷酸化抗体得检测样本制备时就是否一定要加NaF等答N a F就是一种广谱磷酸化酶得抑制剂,一般最好加。但就是不加也可以，大部分时候就是不用加得。14、要验证某个细胞上有无该蛋白得存 在，需要做免疫组化与we s t ern b 1 ot 试验不做这两个试验时得一抗与二抗可以共用不答 免疫组化可以用来进行定位，但就 是不能精确定量,而且有时会有假阳性，不 易与背景区分;Western b 1 o t可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量,但就是不能定位、两种实验得一抗有时候不能通用，公司得产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫组化时，就是否适合石蜡切片或者冰冻切片。15、做Wes t ern B 1 ot时，提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用得博士德得一 抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量 已加到120昭,换了个santa cloz得一抗 仍不行。就是什么原因蛋白酶抑制剂单加PMSF行不答怀疑就是样品问题，可能就是儿样品不 能反复冻融;2祥品未加蛋白酶抑制剂、同时，建议检查W e stern B lot过程，提高一抗浓度、对于加蛋白酶抑制剂来说，一般 加PMS F就可以了撮好能多加几中种蛋 白酶抑制剂。OB-31116、细胞水平要做wes t ern bio t，多少细胞提得蛋白够做weste r n blot答一般5x10八6就足够了17、同一样品能同时提RNA又提蛋白么这样对western bl o t有无影响答能，没有问题。18、同一蛋白样品能同时进行两种因子得W estern Blot检测不答当然可以，有得甚至可以同时测几十种样品。19、如果目标蛋白就是膜蛋白或就是胞浆蛋白，操作需要注意什么答如果就是膜蛋白与胞浆蛋白，所用得去 垢剂要温与得多,这时最好加上Na F去抑制磷酸化酶得活性。20、我得样品得蛋白含量很低，每微升不到1微克,但就是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就就是在转膜后染胶发现有得孔所有得蛋白条带都在，只就是颜色变淡了，有什么办法可以解决答您可以加大上样量，没有问题，还有转移 时您可以用减少电流延长时间，加2 0 甲醇、21、想分离得蛋白就是分子量20 0 kd得,SDSPAGE电泳得分离胶浓度多大合适积层胶得浓度又该用多少这么大分子量得蛋白容易作Weste rn B 1 ot不答200kd得蛋白不好做，分离胶用7,积层胶3.5 .22、如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量答可以浓缩样品，也可以根据您得目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30就是不会有问题得。如果已经超了不少了,而且小分子量得也要，可以考虑加大胶得厚度，可以试试1。5mm得、2 3、蛋白变性后可以存放多久答一80C,两年没有问题。最关键两条不要被蛋白酶水解掉;不要被细菌消化掉（也就是被酶水解了）。24、我所测定得蛋白分子量就是10 5KD,按理说分离胶应当采用7o 5 ,但资料却要求分离胶与浓缩胶均采用11 得配方，不知为何答上述提到得两种凝胶均可以使用，因为105KD得蛋白在上述两种胶得线性分辨范围内，但需注意条带位置。25、二抗就是生物素化得抗体，三抗就是亲与素生物素体系，不知釆用这样得方案后，封闭液就是否要作调整，能否再用5得脱脂奶粉呢好像有资料说脱脂奶粉会影响亲与素生物素得生成，就是不解答不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用B S A代替应该好一点.2 6、问一般一次上样得蛋白总量就是多少，跟目得蛋白得表达量有关系不答West e rn Blot 一般上样 3 0 -10 0 微克不等，结果跟目得蛋白得丰度、上样量、一二抗得量与孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好得结果，如果抗体好得话比较容易，抗体不好得话就需要反复地试了，当然有得不适合Wes t e rn Bio t得怎样做也不行、2 7、做组织样品得weste r n得时候，怎样处理样品答必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈得方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一点就就是组织中得蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶得活性（加入P MSF）o28、问大分子量蛋白2 0 0KD，在做wes tern要注意什么呢答做200kd蛋白得Wester n Blot时要注意，分离胶最好选择7 得;剥胶时要小心;转移时间需要相应延长;要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）o29、有什么方法可以提高上样量答a ）可以浓缩样品;增大上样体积来增大上样量;b）用5倍得上样缓冲液来稀释变性3 0.蛋白得上样量有没有什么具体得要求答上样量要根据实验得要求来定，如果要求就是定量与半定量得Wes t ernBlot则上样量要均等，如果只就是要定性，则没有太大得关系，尽量多上就行了，但就是不要超载。31、一抗，二抗得比例就是否重要答比较重要，调整好一抗，二抗得比例，可以去掉部分非特异得本底.32、要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求答对二抗无要求，要瞧您实验条件来选择，一般推荐用H RP标记得二抗。33、免疫组化与West ern B 1 ot可以用同一种抗体不答免疫组化时抗体识别得就是未经变性处理得抗原决定簇（又称表位），有些表位就是线性得，而有得属于构象型;线性表位不受蛋白变性得影响，天然蛋白与煮后得蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果您所用得抗体识别得就是蛋白上连续得几个氨基酸,也就就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化与We s t e rn,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。34、We s t ern Blot中抗体得可以重复应用不答抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但就是如抗体比较珍贵，可反复使用2-3次。稀释后应在2 3天内使用,4度保存，避免反复冻融。3 5、在做 Wes t ern Bio t 时,PVDF 膜用甲醇浸泡得目得答PV D F膜用甲醇泡得目得就是为了活化PVDF膜上面得正电基团，使它更容易 跟带负电得蛋白质结合，做小分子得蛋白 转移时多加甲醇也就是这个目得、3 6、检测同一抗体得磷酸化与非磷酸化得抗原可以在同一张膜上不答河以。37、转膜后经丽春红染色得条带，为什么大蛋白分子得一端得转膜好象不就是很好，为什么答这就是正常得，大分子得蛋白转移得慢，您延长转移时间与电流，大分子一端就会好得多，但就是小分子得就有可能会变淡O3 8 做West e rn B 1 o t时，同样得抗体免疫组化能做出，而Wes tern Bio t却不能答这多半就是抗体得问题，要瞧抗体得说明，就是否能做Western Bio t与免疫组化。3 9、如果就是6 x8转印膜，要加多少一抗答一抗得稀释度就是有说明得，根据您得一抗瞧瞧就知道了，但就是那么大得膜孵育体积一般【少为3 5 mlo40、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果、答无特殊要求。但我们丄般就是上槽放新鲜得缓冲液,下槽可以就是重复使用过一两次得缓冲液41、跑电泳得时候配得胶总就是“缩”就是 什么原因呢就是有得成分不对不答没什么问题，就就是您胶里得水分被蒸 发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了;也可能母液（30 聚丙酰胺）有问题，您可以重新配制一份观 察;能够替换得试剂，尽量换一下，选用好得试剂。4 2、蛋白质得分子量跨度很大，如要分离 小2 1KD冲至6 6KD，大至170KD,可以一次做好不答这么广得分布不好转移，一般建议2 1 kd 与 66kd 可以一起转，1 2 SDSPAGE,湿转 120mA,4 56 0 min就可以 了，可以根据您实验室得经验调节;170kd 用 7SDS- P A GE,200mA 9 0 120 m i no43、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决答可以考虑转移缓冲液中加入2 0 甲醇（就是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质与NC膜得结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0。1SDS，也就是为了增加转移效率;用优质得转移膜，或使用小孔径得NC膜（0、2微米）、4 4、我用得就是可视mark e野但就是电泳总跑不全条带，请问什么原因怎样改善胶用过8，1 0 ，1 2 ，都就是这样、markei就是新买得。答一般来说，就是小分子量Ma r ker跑走 了，增加胶浓度或减少电泳时间试试瞧。当然梯度胶也就是不错得选择、4 5、就是否Weste r n Blot实验半定量一定要加ACTIN内参答对于发表文章得实验最好加内参，实验严谨。4 6、核内抗原We s t ern Blot内参选择什么合适答可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中得 表达就是很稳定得,有很多都可以当成内 参，在网上查查就可以选出您要得内参。47、做半定量 Western Blot,内参卩一 ac t in,GAPDH 哪个好 答选用bet aac t in就可以。48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则不受不受组织来源得影响胞膜与胞浆有区别不答一般来说提取时加入广谱得蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊得方法,一般来说都没有区别。49、转膜后得脱脂奶粉封闭液就是5 得TEST脱脂奶粉”，其中TBST最后那 个T就是Tween不，浓度多大 答就是 Twe e n,配方如TTris- Buff er ed Sal i neTwe en-2 0 TBST,NaCl 8 g，T ris b a se2o 4 2 g 力口水 8 00 m 1 溶解，加 500 1 00 0 u 1 得Tween-20,用 HC1 调节pH 至 7。4,加水定容至 1 LoIII5 0、封闭，一抗，二抗时得温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下答均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度5 1、请问一下PVDF膜与硝酸膜结合蛋白得原理就是什么答一般而言，硝酸纤维素膜就是通过疏水作用来与蛋白质相联，这样得话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上得正电荷与蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。这样得话,PVDF膜与蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。52、怎样才能把胶跑得非常漂亮，泳道都能很直，上样得量与灌胶就是否很重要，电压有什么要求答影响跑胶跑得质量，有以下几个因素1、电压，小得电压会使胶得分子筛效应得 到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩 胶55”分离胶7 5 v就能跑得很好。2、胶得均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀、倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层得分离胶、53、为什么提高大分子量蛋白得转移得时候，小分子量蛋白会丢失一些哪什么原因答小分子得蛋白在转移过程中，会透过膜 去，所以大分子得上去以后，有一部分小分 子得就透过去了。